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            金针菇液体菌种培养过程检测指标的研究


            【发布日期】:2010-03-25

            秦俊哲 魏颖杰 陈 合 吕嘉枥

             

            (陕西科技大学生命科学与工程学院, 陕西咸阳 712081)

             

            金针菇ВFlammulina velutipes)Э谖断拭溃营养丰富,具有防病抗癌功能,可促 进儿童健康成长和智力发育。近年来,其消费量迅速增加,国外金针菇生产已基本实现了工 厂化,国内在引进国外技术的同时也逐渐形成了一套适合国情的规?;苣晟际?。但金针菇菌种生产仍采用固体发酵法,存在生长周期长、菌龄不一致、操作不方便等缺点,而以 液体菌种进行扩大繁殖是规?;姆⒄狗较?。有关金针菇菌种液体培养技术的研究虽有一些报道[1~3],但多以利用发酵液或菌丝体为目的,对培养过程中影响菌丝活性 的生理指标研究甚少,目前尚缺乏有效控制发酵过程的生理指标和技术参数。本文通过研究影响菌丝生长的主要生理指标,如菌丝球数量、pH、还原糖和氨基氮含量以及酶活性与菌丝 生长活性的关系,为金针菇液体菌种工厂化生产过程的控制提供技术参数和科学依据。

             

            1 材料与方法

             

            1.1 材料

             

            1.1.1 菌种 ソ鹫牍骄种“金18”由武汉市新育食用菌研究所提供。

             

            1.1.2 培养基 バ泵媾嘌基:PDA培养基;摇瓶培养基:米粉3%,赤砂 糖1%,酵母膏1%,KH2PO40.1%,MgSO40.05%,VB110μg/100mL,VB250μg/100mL 。

             

            1.1.3 仪器与设备 YJ型超净工作台,江苏省苏州市苏净集团安泰公司 产品;3033型恒温培养箱,江苏省东台电器厂产品;YX280型手提式压力蒸汽消毒器,上海医疗器械工业公司产品;SHZB型水浴恒温振荡器,上海跃进医疗器械厂产品;722型分 光光度计,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂产品;8002型电热恒温水浴锅,北京化玻联医疗器械有限公司产品;pHep型pH计,意大利HANNA公司产品。

             

            1.2 方法

             

            1.2.1 斜面菌种的活化 ソ菌种接于PDA斜面培养基上,于25℃恒温培 养7d,作为下一步摇瓶培养的一级菌种。

             

            1.2.2 摇瓶菌种的制作与培养 ビ500mL三角瓶,培养基装量150mL,于 121℃、0.12MPa压力下灭菌30min,冷却后每瓶接入3块1cm2培养7d的斜面菌种,150r/min 摇床培养8d,培养温度为25℃,每天取一瓶检测各项指标。

             

            1.2.3 指标测定

             

            1.2.3.1 菌球计数 吸取1mL培养液稀释至10mL,取1mL稀释液置平皿中,皿下衬黑白相间方格纸计数。

             

            1.2.3.2 pH值测定 用pH计测量培养液的pH值。

             

            1.2.3.3 还原糖测定 用3,5捕硝基水杨酸法[4]。

             

            1.2.3.4 氨基氮测定 用甲醛滴定法[5]。

             

            1.2.3.5 羧甲基纤维素酶(CMC酶)活性测定用3,5捕硝基水杨酸法[5], 培养液滤液中羧甲基纤维素酶活性单位定义为1U=1mg葡萄糖/30min·mL。

             

            1.2.3.6 漆酶活性测定 取0.5mL13.36mM的联苯胺作为底物,加入3.4mL 0.1M、pH4.6的 HAC缓冲液,加入0.1mL发酵滤液,于28℃下反应30min,在600nm处测OD值。同时,以0.1mL 煮沸的发酵滤液代替原液作空白对照。培养液滤液中漆酶活性单位定义为1U=ΔOD/min·mL [6]。

             

            WX(16,241.2.3.7 蛋白酶活性测定 用Worthington法[7],培养液滤液中蛋白酶活性单位定义为1U=1mg酪氨酸/15min·mL。

             

            2 结果与分析

             

            2.1 培养液菌丝球数量的变化

             

            ッ扛24h测定培养液的各项生理生化指标并观察菌丝球形态。菌丝球数量的变化情况如图1 所示。

             

            ビ赏1可以看出,培养初期,菌丝球数量增长缓慢,培养第3~6天为菌丝球增长旺盛期,第7天菌丝球数量达到峰值。然后,随着培养液中营养

             

            おおおおおおおおお

             

            ね1 金针菇液体菌种培养液菌丝球数量的变化

             

            Fig. 1 Variation of mycelial pellet nos.in thefermentative liqu id of WTHXF. velutipesWX)

             

             

             

            成分的减少及菌丝活性的减弱,菌丝生长速度开始下降。此生长曲线符合金针菇的一般生长规律。

             

            2.2 培养液pH值的变化

             

            ネ2显示,液体培养期间,培养液的pH变化很小,基本上保持不变,在培养末期略有上升。这是因为金针菇液体培养初期菌丝分解基质产生部分有机酸,培养末期,由于菌丝球老化 自溶产生氨基氮等碱性物质,使培养液的pH略微升高。如果培养后期pH明显降低,溶液浑浊产生泡沫,多为杂菌污染所致。该结果与刘阳等的报道[8]基本一致。

             

            KH10*2

             

            ね2 金针菇液体菌种培养液pH值、还原糖和氨基氮含量的变化

             

            Fig. 2 Variation of pH,reducing sugar and amino nitrogen contents in th e fermentative liquid of WTHXF. velutipes J1

             

            2.3 培养液还原糖及氨基氮含量的变化

             

            ゴ油2可以看出,培养初期,培养液中还原糖含量较低,随着培养时间的延长,还原糖含量迅速增长,培养中期还原糖含量变化平缓,后期又下降,第6天降至3.40g/100mL。培养初 期,虽然菌丝生物量不大,但分解碳源物质的能力很强,还原糖的生成量大于利用量,所以此期间还原糖含量呈上升趋势。随着培养基中碳源物质的消耗和菌丝球数量的增长,培养后 期还原糖含量迅速下降。

             

            ヅ嘌液中氨基氮含量在培养前期变化不大,增长趋势比较平缓,随着培养时间的延长,其含量逐渐增加;培养后期氨基氮含量迅速增长,第7天达到11.10mg/100mL。这是由于培养后 期部分菌丝体蛋白质分解产生氨基氮类物质及菌丝球老化自溶释放出氨基氮类物质所致。

             

             

             

            2.4 培养液酶活性的变化

             

            ネ3显示,培养1~3d,培养液中纤维素酶活性较低,第3天后,纤维素酶活性逐渐增加,第5~6天,纤维素酶活性基本上保持在1.10U左右,为平台期。金针菇依靠自身分泌的各种 酶分解基质中的碳源物质来提供生长发育所需要的能量和营养,而纤维素是一种高分子结构的碳源,必须在纤维素酶作用下才能够分解[9]。因此,菌株纤维素酶活性的高低 可反映菌株活性的强弱。

             

            テ崦富钚缘脑龀け冉匣郝,其变化不明显,峰值出现在第6天,之后,漆酶活性的变化渐 趋平缓,与金针菇的生长曲线基本吻合。本试验中漆酶活性可达0.017U。漆酶是降解木质素 大分子物质的主要酚氧化酶,它能加速木质素芳香族高分子化合物的分解,提供菌丝所需的营养[9]。胞外漆酶活性越高,菌株分解能力越强。因此,漆酶活性可作为反映金 针菇菌丝细胞活性的指标。若漆酶活性强,则底物分解快,菌丝生长速度加快。此外,漆酶代谢所产生的醌类物质的增加,还可以增强菌种的抗病能力,抑制杂菌污染。本试验漆酶活 性的变化不明显,这与培养基中缺乏木质素成分有关。

             

             

             

            ネǔH衔蛋白酶是在基质中可吸收氮源缺乏的情况下,为了获得蛋白质中的氮素而产生的[9],而蛋白酶的主要作用就是分解肽键,使蛋白质降解为小分子的蛋白胨、多肽 或氨基酸等

             

            WX(20。2物质[10]。图3显示,金针菇液体菌种培养液中蛋白酶的变化不大,趋势比较平缓,峰值出现在第6天,酶活性为0.17U。这是由于在金针菇菌丝 生长过程中,对氮源的利用先于碳源,而蛋白酶是在有氮素需求的菌丝体中被大量诱导生成的。这说明金针菇的生长对氮源的需求量较低。 プ芴謇纯矗三种酶的变化趋势基本一致。培养初期,为菌丝的缓慢生长期,酶活性较低。 其后菌丝开始迅速增殖,从而分泌出大量的酶,基质分解速度加快,酶活性增大。第6天后,酶活性不再增加,基本上保持不变,达平台期。培养后期,菌丝球逐渐进入衰退期,酶活 性亦呈下

             

             

             

            ね3 金针菇液体菌种培养液酶活性的变化

             

            Fig. 3 Variation of enzyme activity in thefermentative liquid o f WTHXF. velutipesWX)

             

             

             

            降趋势??杉?,金针菇酶活性的变化与其生长趋势基本相符。

             

            2.5 菌丝球形态的变化

             

            ソ鹫牍揭禾寰种培养过程中,对菌丝球的形态观察结果表明,第1~3天为菌种块萌发定植 期,培养液颜色清亮,菌丝片段增多,出现分枝;第4~6天,菌种块沉没,培养液中菌丝球 由小变大,边缘呈绒毛状,数量明显增多,培养液变稠;第7天,菌丝球密度最大,但菌丝球颜色泛黄;此后,菌丝球边缘变得光滑,密度渐减,菌丝球自溶加快,培养液变得浑浊。 此观察结果与金针菇液体菌种培养液中的菌丝球数量、pH、还原糖和氨基氮含量及纤维素酶、漆酶、蛋白酶活性的变化情况基本一致。

             

            4 结论

             

            プ酆弦陨涎芯拷峁可以看出,在金针菇液体菌种培养过程中,菌丝球数量在第7天达到峰 值,但酶活性一般在第6天最高,这说明酶活性的峰值与菌丝球数量的峰值不是同时出现的 ,以酶活性的峰值作为液体菌种培养终点的参数比较合理。而且,在第6天,培养液中的还原糖含量也开始下降,氨基氮含量又有所上升,这表明菌丝球活性最强。继续培养,则菌丝 球活性下降,说明培养终点应控制在第6天。因此,要想获得质量好、产量高的液体菌种,将菌丝球的形态观察结合培养液中菌丝球数量、pH值、还原糖和氨基氮含量,以及酶活性 的测定作为控制指标,是一种有效而可靠的监测方法。本试验结果为金针菇液体菌种培养过程的控制提供了比较可靠的技术参数,若以该参数作为液体菌种实际生产中的控制指标,尚 有待进一步研究。

             

            参 考 文 献

             

            [1] 柯丽霞. 深层培养条件下金针菇菌丝生长的营养要求[J]. 安徽师范大学学报,1994,17(2):71~73.

             

            ぃ2] 刘 勇, 张长铠, 李昆峰. 金针菇FV088深层发酵工艺的研究[J]. 食品与发酵工业, 1997, 24(3):7~12.

             

            ぃ3] 乔长晟, 汤凤霞, 王文辉. 金针菇液体发酵工艺条件的研究[J]. 宁夏农 学院学报, 2001,22(2):42~43.

             

            ぃ4] 林维宣, 张水华, 董文宾,等. 食品分析[M]. 北京:中国轻工业出版社, 1994.9.

             

            ぃ5] 苏拔贤, 范培昌, 程明哲, 等.生物技术导论[M]. 北京:人民教育出版社 , 1978.9.

             

            ぃ6] 王宜磊, 岳 辉. 大型真菌漆酶的研究[J]. 食用菌, 1999,21(2):3~4.

             

            ぃ7] B.施特尔马赫(钱嘉渊译). 酶的测定方法[M]. 北京:中国轻工业出版社, 1992.8.

             

            ぃ8] 刘 阳,张润清,吴怡莹,等. 金针菇深层发酵条件的研究[J]. 大 连轻工业学院学报,1995,14(4):54~57.

             

            ぃ9] 宋爱荣, 韩立忠, 刘作亭, 等. 七个白色金针菇菌株发酵液中四种 胞外酶活性的测定与分析[J].中国食用菌,1998,18(4):31~34.

             

            ぃ10]尉晓宇.食用菌酶学的应用研究[J].中国食用菌, 1999,19(5):15~16.

             
             
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